Квамател (фамотидин) против окислительного стресса

Квамател (фамотидин) против окислительного стресса

Развитие многих заболеваний пищеварительной системы сопровождается окислительным повреждением тканей вследствие образования в них активных форм кислорода (АФК). Присоединение к этому недостаточного функционирования систем антиоксидазной защиты ведет к

С.Г. Хомерики, Н.М. Хомерики, В.Г. Сафронов; Пущинский медицинский центр МО РАН, Институт биофизики клетки РАН; г. Пущино, Россия

Развитие многих заболеваний пищеварительной системы сопровождается окислительным повреждением тканей вследствие образования в них активных форм кислорода (АФК). Присоединение к этому недостаточного функционирования систем антиоксидазной защиты ведет к развитию окислительного стресса. Из заболеваний, при которых местные и общие проявления окислительного стресса наиболее наглядны, можно назвать острый и хронический панкреатиты, язвенную болезнь, хеликобактерный гастрит.

Несмотря на этиопатогенетические и клинические различия, их объединяет усиление продукции АФК, перекисного окисления липидов, активация, а затем быстрое истощение систем антиоксидазной защиты тканей. К биохимическим проявлениям окислительного стресса относят повышение в крови уровня супероксидных радикалов и уровня малондиальдегида (как проявление увеличения активности перекисного окисления липидов), снижение содержания аскорбиновой кислоты, повышение уровня фосфолипазы А2 и эластазы сегментоядерных лейкоцитов. Активация ферментов антиоксидантной защиты – супероксиддисмутазы, каталазы, глютатионпероксидазы – наблюдается в начальных стадиях заболевания, а затем их активность быстро падает [6, 28]. Основной источник АФК в организме – нейтрофильные гранулоциты крови. Будучи носителями готового эффекторного потенциала и обладая способностью к быстрой его реализации, нейтрофилы являются одним из главных участников ранней ответной реакции на любые изменения в тканях организма. В норме нейтрофилы находятся в крови в неактивном состоянии.
При стимуляции нейтрофилов активируются оксидазы плазматической мембраны, которые запускают серию метаболических реакций, характеризуемых как «респираторный взрыв». Этот термин отражает быстрое изменение метаболизма нейтрофилов с активацией внутриклеточной миелопероксидазы, увеличением потребления и окислением глюкозы, ростом поглощения кислорода и генерацией АФК: супероксидного анион-радикала, перекиси водорода, гидроксильного радикала и синглетного кислорода.
В течение секунд после активации нейтрофилов уровень продукции АФК в них увеличивается более чем в 100 раз. Активированный фермент НАДН-оксидаза катализирует кислород в супероксиданион. Последний представляет собой высокоактивный кислородный радикал, который через ряд промежуточных реакций генерирует такие токсические продукты, как гидроксильный радикал, гипохлорная кислота и хлорамин. Гидроксильный радикал весьма токсичен, но он не может диффундировать в ткани и действует непосредственно в местах образования. Высокая токсичность хлорамина обусловлена его способностью вызывать пероксидацию и растворение мембран. Эти вещества могут взаимодействовать практически с любым классом органических веществ, включая ДНК, т.е. являются мутагенами. Обладая выраженным бактерицидным действием, АФК выполняют в организме защитную функцию, но они весьма токсичны также для митохондрий эндотелиальных клеток и коллагеновых волокон, способны разрушать свободные аминокислоты (цистеин и лизин). Цитотоксическая активность нейтрофилов обусловлена именно продукцией АФК.
При развитии острого панкреатита у больных наблюдается выраженное окислительное повреждение тканей. В крови резко повышается содержание АФК и уровень перекисного окисления липидов, наблюдается истощение запасов аскорбиновой кислоты, обладающей антиоксидантным действием. Эти изменения имеют значимую корреляцию с тяжестью состояния больного [11, 26, 28].
Выделяют две морфогенетические формы острого панкреатита: острый геморрагический панкреатит и жировой панкреонекроз («гнойный панкреатит») [2]. Существенным отличием жирового панкреонекроза от геморрагического панкреатита является интенсивная миграция нейтрофилов в очаги липолитических повреждений ацинарной и жировой ткани. Они инфильтрируют межацинарную соединительную ткань и периацинарные пространства, создавая картину острого гнойного воспаления. По-видимому, продукты незавершенного протеолиза и липолиза при жировом панкреонекрозе обладают выраженными хемоаттрактантными свойствами, тогда как зоны фибриноидного некроза сосудов и участки колликвационного протеолитического некроза при геморрагическом панкреатите не содержат таких хемоаттрактантов и ареактивны для лейкоцитов.
Локальная генерация АФК в поджелудочной железе с помощью ксантин-оксидазной реакции не приводит к развитию острого панкреатита [21], однако их воздействие вызывает быструю гибель культуры ацинарных клеток поджелудочной железы in vitro [24]. По-видимому, АФК не играют этиологической роли в развитии острого панкреатита, а роль эта, скорее всего, патогенетическая и отражает активированный статус нейтрофилов. Непосредственная причина этого состояния нейтрофилов при остром панкреатите – активация элементов системы комплемента в крови, вызванная, в свою очередь, уклонением в кровь таких ферментов поджелудочной железы, как трипсин [3]. Нейтрофилы и генерируемые ими АФК утяжеляют течение острого панкреатита, являясь медиаторами деструкции ацинарных структур. Системная активация нейтрофилов способствует прогрессированию острого панкреатита и развитию осложнений, в частности поражению легких [10, 13, 18, 21]. Введение антилейкоцитарной сыворотки в экспериментальной модели острого панкреатита полностью предотвращает эти осложнения [5, 12, 13].
Усиленное образование АФК отмечено также в слизистой оболочке желудка при хроническом хеликобактерном гастрите (рис. 1). Helicobacter pylori (H. pylori), попадая в организм, вызывает развитие острого воспаления в слизистой оболочке желудка с привлечением в эту зону нейтрофилов и их активацией [20]. Уменьшение содержания в слизистой оболочке желудка при хеликобактерной инфекции восстановленного глютатиона свидетельствует о снижении активности антиоксидантной системы, а увеличение уровня малондиальдегида – об усилении перекисного окисления липидов с повреждением мембранных структур клеток [23]. Взаимодействие АФК с продуктами метаболизируемой хеликобактером мочевины приводит к возникновению соединений типа монохлорамина, обладающих свойством повреждать ДНК [25]. Кроме того, H. pylori сам является носителем ферментов, способных генерировать АФК [16].
Присутствие четко очерченного патогенетического звена в виде проявлений окислительного стресса представляет собой заманчивый объект для терапевтического воздействия. Раннее использование различных антиоксидантов и доноров оксида азота существенно снижает тяжесть морфологических проявлений острого панкреатита, однако этот эффект кратковременен и эффективен лишь на ранних стадиях в фазе острого отека поджелудочной железы [9].
Исходя из вышеизложенного, для борьбы с проявлениями окислительного стресса представляется перспективным использовать антиоксидантные свойства селективных блокаторов Н2-рецепторов гистамина. В отечественной литературе отсутствуют данные об одном из важнейших свойств Н2-блокаторов – подавлять генерацию АФК в биологических системах. Из зарубежных публикаций известно, что высокие концентрации гистамина усиливают продукцию АФК в нейтрофилах за счет активации НАДН-оксидазы [4]. Н2-блокаторы подавляют генерацию супероксиданиона в нейтрофилах [29], блокируют реакции, катализируемые миелопероксидазой [27]. По своей способности блокировать активность гидроксильного радикала Н2-блокаторы в несколько раз превосходят известный скавенджер (вещество, инактивирующее что-либо путем прямого связывания) АФК – маннитол [8]. При этом они не являются истинными скавенджерами АФК. Н2-блокаторы действуют лишь в биологических системах с мембраноассоциированной ферментативной активностью, и действие это является кальцийзависимым [17]. Кроме того, Н2-блокаторы усиливают активность важнейшего антиоксидазного фермента – супероксиддисмутазы [15].
Наиболее вероятно, что этими уникальными свойствами Н2-блокаторов объясняется быстрый положительный системный эффект при лечении заболеваний пищеварительной системы. Одним из наиболее эффективных представителей семейства селективных блокаторов Н2-рецепторов гистамина 3-го поколения является фамотидин. Лишенный серьезного побочного действия, этот препарат широко применяется в лечении язвенной болезни и хронического гастрита. Лечебное действие препарата связывают в основном с эффективным подавлением кислой желудочной секреции. Инъекционная форма фамотидина с успехом используется при язвенных кровотечениях. Существуют единичные сообщения об использовании Кваматела® в лечении острого и хронического панкреатитов [7].

Цель исследования
Цель настоящего исследования заключалась в оценке влияния инъекционной формы фамотидина (Квамател®, «Гедеон Рихтер» А.О., Венгрия) на продукцию АФК лейкоцитами, выделенными из крови больных острым и хроническим панкреатитами, язвенной болезнью и хроническим хеликобактерным гастритом.

Материалы и методы
Под наблюдением находилось 35 больных хроническим панкреатитом, 3 – с острым панкреатитом, 35 больных язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки и 17 больных хроническим хеликобактерным гастритом. Возраст больных – 18-69 лет. Длительность заболевания – от 2 дней до 18 лет. Больным панкреатитом вводили по 20 мг Кваматела® внутривенно каждые 8 часов в течение 3-5 дней в зависимости от выраженности болевого синдрома. При язвенной болезни, осложненной кровотечением, Квамател® включали в комплекс стандартной гемостатической терапии, а после остановки кровотечения и стабилизации состояния больного переводили на таблетированную форму Кваматела® в виде монотерапии или в комплексе антихеликобактерного курса. При хеликобактерном гастрите таблетированная форма Кваматела® использовалась в комплексе эрадикационной терапии в дозировке 80 мг в сутки в течение 7-10 дней с последующей поддерживающей терапией в дозе 40 мг в сутки в течение 14 дней. Кровь для исследования в количестве 10 мл получали из локтевой вены до начала лечебных мероприятий, через 1 час после внутривенного введения Кваматела® и затем в середине курса лечения Квамателом®. Выделение нейтрофилов проводили одномоментным центрифугированием в градиенте плотности фиколл-верографин. Остаточные эритроциты удаляли с помощью осмотического шока. Жизнеспособность суспензии нейтрофилов в тесте с трепановым синим была не менее 97%. Для инициации респираторного взрыва в нейтрофилах использовали индукторы с различным механизмом действия: маннозоспецифический лектин – конканавалин А (Con A), хемотаксический полипептид (fmlp) и форболовый эфир (РМА).
Генерация АФК активированными нейтрофилами сопровождается возникновением длительной (в течение нескольких минут) световой эмиссией – хемилюминесценцией, которая усиливается в присутствии люминола. Количественный учет световой эмиссии проводили с помощью хемилюминометра, сконструированного в Институте биофизики клетки РАН (г. Пущино).
В пластиковую ячейку вносили 80 мкл суспензии нейтрофилов (106 клеток в 1 мл), добавляли 100 мкл буфера Хенкса рН 7,4 и 7 мкл люминола (10–2 М). После записи фонового уровня фотоэмиссии добавляли 10 мкл индуктора и продолжали запись показателей, которые затем подвергали компьютерному анализу.
На буфере Хенкса готовили различные разведения Кваматела®, начиная с концентрации 2 мг/мл (концентрация раствора, используемого для внутривенной инфузии) до 0,002 мг/мл (конечная действующая концентрация в крови). Реакцию клеток на индукторы определяли раздельно с каждым из разведений Кваматела®. Уровень генерации АФК нейтрофилами оценивали по интегративному показателю фотоэмиссии за определенный период времени (от 2 до 15 минут) в зависимости от вида индуктора и формы ответной реакции клеток. Процент снижения уровня генерации АФК высчитывали из сравнения интегративного показателя хемилюминесценции клеток в среде без Кваматела® с аналогичным показателем в среде с различными концентрациями Кваматела®.

Результаты
У больных с острым и хроническим панкреатитом (за исключением 2 случаев, осложненных геморрагическим панкреонекрозом) наблюдалась положительная динамика в купировании болевого синдрома после первых же инъекций Кваматела®. У больных, получавших курс антихеликобактерной терапии с Квамателом®, болевой синдром купировался полностью в течение первых 5 дней лечения, а также исчезали изжога и другие диспепсические явления. Побочные реакции в виде диареи и горечи во рту не отличались от таковых при других антихеликобактерных схемах, легко переносились и не требовали прекращения лечения. Эрадикация H. pylori наблюдалась в 60-90%, в зависимости от вида терапии.
Отмечено улучшение общего состояния больных, получавших инъекционную форму Кваматела® по поводу язвенных кровотечений и панкреатитов. У них уменьшались головные боли, раздражительность и другие проявления астенического синдрома.
При определении уровня генерации АФК в нейтрофилах, активированных различными индукторами, не обнаружено достоверных различий между группами больных панкреатитами, язвенной болезнью и хеликобактерным гастритом.
Квамател® в концентрации 2 мг/мл почти полностью подавлял генерацию АФК в ответ на все индукторы. С уменьшением концентрации Кваматела® ответ на активацию различными индукторами носил четко выраженный дозозависимый характер (рис. 2).
При использовании Con A, в отсутствие в среде Кваматела®, при респираторном взрыве резко возрастало образование АФК в суспензии нейтрофилов. Однако уже терапевтическая концентрация Кваматела® подавляла продукцию АФК на 34%, а увеличение концентрации в 100 раз позволяло подавить ее на 67%.
Уровень генерации АФК в ответ на стимуляцию хемотаксическим пептидом (fmlp) при терапевтических концентрациях Кваматела®практически не изменялся, но 100-кратное увеличение концентрации также позволяло снизить его на 65%.
В значительно меньшей степени эффективность респираторного взрыва зависела от концентрации Кваматела® в среде при использовании в качестве индуктора форболового эфира (РМА).
В начале лечебных мероприятий уже однократная инфузия Кваматела® существенно изменяла свойства нейтрофилов и их ответ на различные индукторы респираторного взрыва. При этом уровень генерации нейтрофилами АФК не превышал в среднем 35-40% от того, что был до введения Кваматела®, независимо от типа активирующей субстанции. Аналогичные изменения наблюдались и после приема Кваматела® внутрь. Однако в этом случае эффект был отсрочен на несколько часов.

Обсуждение
Активация нейтрофилов в крови и, соответственно, изменение их реакции на индукторы служит одним из проявлений окислительного стресса. Окислительный стресс – важное патогенетическое звено в развитии и течении как острого, так и хронического панкреатита, независимо от этиологии [11, 26]. Однако если острый панкреатит развивается по геморрагическому типу, то активации нейтрофилов, а следовательно, и развития окислительного стресса не наблюдается [14].
Острая легочная недостаточность, являющаяся тяжелым осложнением острого панкреатита, обусловлена поражением легких активированными нейтрофилами и сопровождается повышением проницаемости легочных сосудов.
Активированные нейтрофилы вырабатывают большое число различных биологически активных веществ, взаимодействующих с тромбоцитами, эндотелиальными клетками [22]. Это приводит к соответствующим изменениям гомеостаза в системе тромбообразования, а также сосудистой проницаемости и кровоснабжения органов и тканей. С одной стороны, продуцируемые нейтрофилами АФК и лейкотриены вызывают агрегацию тромбоцитов, а с другой стороны, ряд продуктов активации тромбоцитов (серотонин, эпинефрин, АДФ, АТФ) усиливает адгезивные свойства нейтрофилов. Присутствие тромбоцитов индуцирует хемотаксис нейтрофилов, а также генерацию ими АФК. Н2-блокаторы обладают свойством подавлять агрегацию тромбоцитов, улучшая таким образом реологические свойства крови [19].
Особенности реакции нейтрофилов на Con A, PMA и fmlp, а также механизмы активирующего воздействия последних хорошо изучены. РМА усиливает проницаемость мембран, ведет к быстрой активации цитоплазматической протеинкиназы С и массивной дегрануляции нейтрофилов. Хемотаксический пептид повышает текучесть и подвижность мембран через гидролиз фосфатидилинозитола, приводит к экспрессии интернализированных рецепторных структур и активации связанных с ними оксидазных ферментов. Con A активирует окислительный метаболизм через взаимодействие с маннозосодержащими гликопротеидными компонентами цитоплазматической мембраны.
Наши исследования показали, что Квамател® в разной степени подавляет вызванную различными индукторами активацию нейтрофилов. Функция рецепторов, ответственных за хемотаксис нейтрофилов и проницаемость их мембран, при терапевтических концентрациях Кваматела® практически не затрагивается, тогда как функция рецепторных структур, ответственных за генерацию АФК, существенно подавляется. Наши данные по изучению Кваматела® находят подтверждение в публикациях, посвященных изучению свойств других Н2-блокаторов.
Все Н2-блокаторы подавляют генерацию АФК в нейтрофилах, не влияя на их хемотаксис и фагоцитоз, что весьма существенно, так как организм не остается беззащитным перед возможной инфекцией [17]. Так как Н2-блокаторы не являются скавенджерами супероксиданиона или перекиси водорода, генерируемых в химических реакциях (например, в ксантин-оксидазной системе), то их действие, скорее всего, опосредовано через мембранные структуры живых клеток. При этом наблюдается специфическое блокирование участков плазматической мембраны, воспринимающих стимулы, активирующие окислительный метаболизм в клетках. Механизмы этого действия проявляются только в присутствии ионов кальция.
Отмеченное нами при лечении панкреатитов устранение болевого синдрома после инфузии Кваматела® вряд ли можно объяснить лишь снижением кислой желудочной секреции с последующим уменьшением давления в протоках. Тем более, что не обнаружено четкой корреляции между уровнем протокового давления и болевым синдромом [1]. Фактором, способным индуцировать боль, может быть периневральное воспаление в ткани поджелудочной железы с усилением лейкоцитарной инфильтрации. Именно это патогенетическое звено, по-видимому, и служит мишенью для антиоксидантного действия Кваматела®.
Выраженность окислительного стресса в слизистой оболочке желудка при хеликобактерном гастрите и язвенной болезни усугубляется и тем обстоятельством, что не только нейтрофилы, но и сам H. pylori является источником образования АФК. Поэтому представляется целесообразным включение Кваматела® во все схемы антихеликобактерной терапии, чего нет в классической тройной терапии на основе препаратов висмута.
Таким образом, высокая терапевтическая эффективность Кваматела® при хроническом хеликобактерном гастрите, язвенной болезни и панкреатитах обусловлена не только подавлением кислой желудочной секреции, но и его выраженными антиоксидантными свойствами. Этот системный эффект Кваматела® наблюдается как при внутривенном введении, так и при пероральном приеме. Однако внутривенное введение инъекционной формы Кваматела® дает существенный выигрыш во времени, что особенно важно для своевременного блокирования патогенетических механизмов прогрессирования панкреатита.